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準備碎冰和。把膜置于甲醇溶液中活化1分鐘，然后轉移至轉膜液中平衡3分鐘后備用。2、轉膜組裝轉膜三明治夾，這一步很關鍵，重要的是膠和膜之間不能有氣泡且膜與膠要保證貼合緊密(否則會翻車)，可以加多點轉膜液泡著。組裝好后加滿轉膜液，設置電源參數，我習慣恒流轉膜，200-280毫安，1-2小時，根據分子量定，如50KD的分子用60分鐘就夠了。如果一個電源帶兩個轉膜大槽即四塊膠，我就會用恒壓70-110V。這個過程重要的是做好降溫。這里簡單說一下蛋白分子量與玻璃板厚度，分離膠的濃度，轉膜電源參數的選擇問題。如果是能用1毫米的玻璃板就不用，因為轉膜是在電場的作用下蛋白分子從膠上遷移到膜上，1毫米膠的蛋白遷移距離要比。選擇更薄的膠蛋白轉膜時間可以減少，從而減少發熱，以免膠變形，條帶也會更好看。然后是分離膠的濃度，如果是150—200KD的分子選10%以下的的分離膠，200—300KD的選8%的,300KD以上的選6%的，小于30KD的200mA30分鐘，30-100KD的按分子量的數值算，如70KD，250mA70分鐘;100-150KD的250mA100分鐘;150—300KD的分子轉膜條件用280毫安(以上均是對于，)，120分鐘足矣，前提是膠的濃度相適應。五、封閉孵一抗1、封閉轉膜結束后。瘤細胞的增殖活性，從而更好地評估腫、瘤的惡性程度和預后.模式科研技術服務購買

膿毒癥動物模型必須具備以下基本要素：有膿毒癥典型的高排低阻血流動力學表現和高代謝狀態；伴發多個功能障礙；有較高的自然死亡率，根據膿毒癥的轉歸，要求動物模型的自然死亡率達到50%～70%；膿毒癥是嚴重引起機體的炎癥反應過度造成的自身損傷，不是細菌和內對機體的直接損傷，故出現功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應有一定的時間間距。一般在制模后6～12h后發生的功能障礙或死亡屬全身炎癥反應所致。實驗動物的選擇在制作動物模型時多選用雄性小鼠，因為雌性小鼠較雄性小鼠更能耐受膿毒癥和失血性休克，且進入發期的雌性小鼠性水平變化很大，而雄性小鼠在膿毒癥時更易于發生免疫抑制。為什么選擇CLP模型？盲腸結扎穿孔模型（CLP）模型是接近于人類膿毒癥機制的模型，被稱為膿毒癥模型的“金標準”。CLP技術在20世紀70年代被建立。CLP模型非常適宜用于防治膿毒癥或膿毒性休克新藥的臨床前觀察造模方法CLP膿毒癥模型的建立主要分為兩個階段：盲腸遠端結扎和盲腸穿刺。首先是手術引發的結扎部位組織變性壞死引起局部炎癥反應，其次是穿孔后使糞便內容物漏入腹膜引起多菌性細菌性腹膜炎，進而誘發全身性炎癥反應。河北組織科研技術服務購買干貨分享｜選對實驗室常用培養基DMEM和1640。

轉錄組和m6A分析顯示精子發生相關基因的表達和選擇性剪接發生了改變[19]。YTHDC2可促進靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發生過程中起關鍵作用。當減數分裂開始時YTHDC2表達上調，YTHDC2敲除小鼠的生殖細胞沒有經過偶線期的發育導致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應中，METTL3可促進DNA聚合酶κ（Polκ）與核酸剪切修復途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點，當缺失METTL3時，細胞無法迅速修復UV照射引起的突變，并且對UV照射更加敏感[25]。在淋巴細胞性小鼠過繼轉移模型中，Mettl3缺陷通過影響mRNAm6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達水平，從而抑制IL-7介導的STAT5活性和T細胞內穩態增殖和分化，進而抑制腸炎的發生[21]。在肝中，METTL14通過調控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝的轉移[22]。在乳腺細胞中，低氧刺激能促進依賴低氧誘導因子HIF的ALKBH5的表達，而ALKBH5過表達降低了NANOGmRNA的m6A修飾，從而穩定mRNA提高NANOG的表達水平，終增加乳腺干細胞所占的比例[23]。此外，低氧誘導乳腺細胞中依賴ZNF217的NANOG和KLF4的mRNAm6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除降低免疫缺陷小鼠乳腺的肺轉移[24]。在肺中。

且研究表明HNRNPC通過m6A與RNA結合調控目標轉錄本的豐度和選擇性剪切[9].圖1m6A修飾的酶系統[10]m6A生物學功能越來越多的證據表明m6A修飾在哺乳動物中發揮重要的生物功能。例如，在轉錄水平上調控RNA的穩定性[11]、定位[12]、運輸、剪切[13]和翻譯[14]。ClaudioR.等發現依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會促進DGCR8識別和加工，從而促進microRNA的成熟[15]。此外，m6A識別蛋白HNRNPA2B1促進pri-miRNA加工成pre-miRNA[16]。另外，環狀RNA上m6A的修飾能促進環狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達調控中起著重要的作用，其調控機制的異常可能與人類疾病或相關。目前發現m6A可能會影響精子發育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導的DNA損傷反應（METTL3，FTO）、生成（YTHDF2）或轉移（METTL14）、干細胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節律、細胞發育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點是凋亡影響減數分裂中期的精子細胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]，在生殖細胞中，METTL3的敲除嚴重抑制精子分化和減數分裂的發生。干貨分享 | 避坑，微生物培養的污染因素及預防方法，少走彎路。

如果實驗平臺的儀器需要提前預約，建議提前規劃好使用的時間。反復總結尋找答案在整個預實驗的過程中可能會出現很多問題。比如造模效果欠佳、灌胃操作不當、腹腔注射操作失誤、使用不當等引起動物死亡。每遇到問題都需要自己想辦法解決，可以從導師、師兄師姐、文獻、貼吧、視頻教程等找到答案。比如筆者曾遇到同樣的給，發現有的大鼠得很深，有的大鼠還活蹦亂跳，在反復嘗試調整濃度，給劑量，更換方式，后來才發現是動物體重秤的準度有問題，導致體重秤得不準。因此，需要自己反復琢磨到底是實驗過程中哪一個環節出現問題，逐一排除。也要求在每一個實驗步驟需要標準化，統一化，盡可能的排除干擾因素，這樣方便在遇到問題快的找到答案。同時，建議每日總結，大到動物死亡原因分析，小到灌胃操作耗時多長時間。建議反復總結出每天實驗的優缺點。做任何一個操作之前，建議提前腦海中反復模擬，準備好相關工具和試劑，避免臨用之際缺少的，影響實驗操作節奏和個人心情。筆者曾經灌胃操作的時候發現竟然忘帶了，只好重新回實驗室準備，那真叫一個郁悶。仔細記錄每日實驗過程無論是碩士還是博士，導師給我們上的堂課往往就是交代我們要詳細記好實驗記錄，只要是和實驗相關的。實驗干貨 | 常用分子生物學技術原理.模式科研技術服務購買

隨著跨學科研究的深入開展，動物疾病模型將在未來發揮更為普遍的作用，成為生命科學、醫學等領域研究工具。模式科研技術服務購買

我們知道WB實驗步驟繁瑣，一次實驗歷時也不短，從提蛋白到顯影結束可能要三天，我們就講一下這里面的一些關鍵環節。一、蛋白提取及變性1、提取蛋白很多經驗豐富的WB實驗者都深有體會，蛋白提取是影響結重要的環節之一。該過程重要的是防降解和保證蛋白濃度不要太低。防降解主要有兩點，一是裂解前注意保持樣品處于低溫環境中，二是裂解時加入足夠的蛋白酶抑制劑。我們習慣先用冰冷的PBS做心臟的體循環灌注，然后冰上取腦，分離各腦區(嗅球，皮層，海馬，中腦，小腦，延髓，丘腦，紋狀體)后置于，用液氮速凍后轉移至-80度冰箱長期保存。接著是保證蛋白濃度，即要加入適量的裂解液，加太少會使蛋白提取不充分，加太多會讓蛋白濃度太低，一般經驗是這樣的，細胞樣品例如一個六孔板的細胞加60微升的裂解液，動物組織的話每毫克組織加10微升裂解液。還要加上超聲破碎處理，具體方案見討論部分。如果沒有超聲破碎儀，那就用1毫升注射器不斷抽吸，冰上反復抽吸1分鐘左右，注意不要產生過多氣泡。(需要灌注取材的視頻可以私聊獲取，由于文件過大，又比較血腥，不宜直接放到文章里。)2、蛋白變性加入上樣緩沖液后100攝氏度煮10分鐘，這里的上樣緩沖液有兩種可選。模式科研技術服務購買