E.coli克隆菌宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)方法開發(fā)

湖州申科生物憑借自主可控的供應(yīng)鏈與經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證的技術(shù)性能，確保 HCP 檢測(cè)試劑盒的長期穩(wěn)定供應(yīng)及出色分析能力。一方面，公司實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵物料自研自產(chǎn)：校準(zhǔn)品通過凍干工藝大規(guī)模生產(chǎn)，能穩(wěn)定儲(chǔ)存 10 年以上；抗體經(jīng)大動(dòng)物免疫制備，產(chǎn)量可支撐≥10,000 盒試劑盒生產(chǎn)，確保同批次抗體連續(xù)供應(yīng)超 10 年；試劑盒經(jīng)多批次驗(yàn)證，批內(nèi)與批間一致性表現(xiàn)良好。另一方面，所有產(chǎn)品均參照 ICH Q2（R2）及 ICH M10 法規(guī)要求完成驗(yàn)證：以大腸桿菌（E.coli）HCP 產(chǎn)品為例，其線性范圍（1-243 ng/mL）的 R2>0.999，各濃度點(diǎn)回收率偏差≤5%；準(zhǔn)確度處于 81.2%-111.6% 區(qū)間，中間精密度 CV 值為 5.7%-12.4%；定量限（LLOQ）低至 1.5 ng/mL，且對(duì) CHO、HEK293 等多種宿主細(xì)胞的交叉反應(yīng)均低于檢測(cè)限。同時(shí)，借助二維電泳（檢出 826 個(gè)蛋白點(diǎn)）與質(zhì)譜法（鑒定 2204 個(gè)蛋白點(diǎn)）對(duì)校準(zhǔn)品進(jìn)行雙重表征，并運(yùn)用 IMBS-2D（覆蓋率 > 70%）與 IMBS-MS（覆蓋率 84.7%）正交技術(shù)驗(yàn)證抗體覆蓋率，從源頭保障檢測(cè)結(jié)果的全面性與可靠性。

由于 HCPs 屬于復(fù)雜的多分析物，為制備覆蓋率盡可能高的抗體（以覆蓋工藝特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCPs），需采用可靠的免疫策略。獲得符合性能要求的抗體后，需借助經(jīng)過驗(yàn)證的 2D 或 LC-MS 方法對(duì)抗體覆蓋率進(jìn)行表征，確?？贵w可充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的 HCPs。在擁有代表性抗原與優(yōu)良性能抗體的基礎(chǔ)上，開展 ELISA 檢測(cè)體系開發(fā)，涵蓋原輔料篩選與制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等重要內(nèi)容。檢測(cè)體系開發(fā)完成后，需依據(jù) ICH 及藥典要求開展分析方法驗(yàn)證評(píng)估，確保體系的線性、范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性及耐用性均滿足法規(guī)要求。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)中，抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)的操作難度較高，需在實(shí)驗(yàn)方法建立階段對(duì)關(guān)鍵步驟開展充分驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開發(fā)過程中已對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分驗(yàn)證，相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果已通過專業(yè)評(píng)審，具體驗(yàn)證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開展優(yōu)化驗(yàn)證，確保方法穩(wěn)健性；② 過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、時(shí)間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問題，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)引入熒光標(biāo)記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時(shí)在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設(shè) 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過程；③ 方法重復(fù)性：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析開展重復(fù)性驗(yàn)證，其中 2D 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 90% 以上；④ 上樣量?jī)?yōu)化：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析實(shí)施上樣量驗(yàn)證，規(guī)避上樣量差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；⑤ 假陽性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認(rèn) IMBS 實(shí)驗(yàn)設(shè)定的步驟與參數(shù)是否會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

MDCK（Madin-DarbyCanineKidney，馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞）細(xì)胞系是源于犬腎的持續(xù)性細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于流感病毒增殖純化、流感疫苗生產(chǎn)等過程，作為細(xì)胞基質(zhì)使用。憑借高病毒產(chǎn)量與滴度、無適應(yīng)性突變、易馴化等優(yōu)勢(shì)，MDCK細(xì)胞已成為業(yè)界公認(rèn)的流感病毒毒株分離及流感疫苗生產(chǎn)適配細(xì)胞系。和其他產(chǎn)品雜質(zhì)類似，MDCK宿主殘留蛋白（HCP）可能對(duì)生物制品的安全性與有效性產(chǎn)生不良影響，因此在生產(chǎn)監(jiān)測(cè)、產(chǎn)品放行等環(huán)節(jié)，需對(duì)其開展定量研究并實(shí)施嚴(yán)格控制。SHENTEK^®MDCK HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），是湖州申科生物自主研發(fā)、擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且關(guān)鍵試劑實(shí)現(xiàn)全國產(chǎn)化的MDCK HCP通用檢測(cè)試劑盒。該試劑盒適用于基于MDCK細(xì)胞基質(zhì)的病毒增殖純化、疫苗生產(chǎn)等過程，可對(duì)其中的MDCK宿主殘留蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，且操作步驟簡(jiǎn)便快捷、檢測(cè)專一性高、性能穩(wěn)定可靠。

磷脂酶 B 樣蛋白 2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），憑借強(qiáng)共純化能力、高免疫原性及潛在酶活性，被認(rèn)定為 CHO 宿主細(xì)胞蛋白（HCP）中的關(guān)鍵高風(fēng)險(xiǎn)因子之一。當(dāng)前行業(yè)建議，需針對(duì)性開發(fā)特定檢測(cè)方法，對(duì)這類已知或特定蛋白進(jìn)行監(jiān)控，以更有效把控其潛在風(fēng)險(xiǎn)。SHENTEK^® CHO PLBL-2 殘留檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）由湖州申科生物自主研發(fā)，擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，是一款 CHO PLBL-2 蛋白通用檢測(cè)試劑盒。該試劑盒適用于對(duì) CHO 表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的生物制品中，CHO HCP 高風(fēng)險(xiǎn)蛋白 PLBL-2 進(jìn)行定量檢測(cè)，且操作步驟少、檢測(cè)快速，兼具強(qiáng)檢測(cè)專一性與穩(wěn)定可靠的性能。

定制化試劑盒之所以成為宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇，關(guān)鍵原因之一是其構(gòu)建的檢測(cè)體系更契合商業(yè)化生產(chǎn)中HCP工藝雜質(zhì)的控制需求。在HCP校準(zhǔn)品與HCP抗體這兩大關(guān)鍵試劑組分達(dá)標(biāo)后，定制化方法的建立與優(yōu)化會(huì)依托真實(shí)的純化中間品及原液樣品開展——通過優(yōu)化檢測(cè)條件提升對(duì)低濃度HCP的檢測(cè)靈敏度，從而滿足工藝驗(yàn)證與過程控制的需求。臨床三期階段需對(duì)生產(chǎn)工藝開展系統(tǒng)驗(yàn)證，以保障其穩(wěn)定性與可重復(fù)性，而定制化HCPELISA檢測(cè)方法能更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)工藝中HCP的去除效果，為工藝驗(yàn)證提供堅(jiān)實(shí)支撐。過程控制環(huán)節(jié)，借助工藝特異型HCP ELISA檢測(cè)方法，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過程中的HCP水平，擁有更強(qiáng)的生產(chǎn)異常預(yù)警能力，能及時(shí)排查生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。