江蘇ELISA法宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測方法學驗證

來源：發(fā)布時間：2025-11-06

宿主細胞蛋白（HCP）多與細胞關(guān)鍵功能相關(guān)，例如細胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細胞存活及凋亡等，在生產(chǎn)工藝中會因細胞分泌、死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程里，有三大因素主要影響 HCP 的組成與豐度：①宿主細胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在 HCP 數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會表達，部分基因的表達具有時間和條件特異性；像大腸桿菌約含 4300 個基因，不同工藝產(chǎn)物會經(jīng)歷獨特的翻譯后修飾，這增加了 HCP 的總數(shù)與生化復雜性。研究顯示，大腸桿菌表達的蛋白間存在數(shù)量差異，這種差異可能是對環(huán)境條件的適應性反應，但 85-90% 具有潛在免疫原性的 HCP 在不同發(fā)酵過程中均會出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達方式：宿主細胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時及誘導表達；以大腸桿菌為例，常見表達形式包括胞內(nèi)表達、分泌表達、可溶性表達、不溶性包涵體形式，還有融合與非融合表達。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性的影響：純化過程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量殘留 HCP 留在產(chǎn)品中，這些殘留 HCP 可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同被純化。

通用型試劑盒為市售廣譜方案，使用前需嚴格評估抗體對特定 HCP 的覆蓋率。江蘇ELISA法宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測方法學驗證

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由于 HCPs 屬于復雜的多分析物，為制備覆蓋率盡可能高的抗體（以覆蓋工藝特有的高風險 HCPs），需采用可靠的免疫策略。獲得符合性能要求的抗體后，需借助經(jīng)過驗證的 2D 或 LC-MS 方法對抗體覆蓋率進行表征，確保抗體可充分覆蓋各實際工藝下產(chǎn)生的 HCPs。在擁有代表性抗原與優(yōu)良性能抗體的基礎上，開展 ELISA 檢測體系開發(fā)，涵蓋原輔料篩選與制備研究、各組分工藝及反應體系研究、穩(wěn)定性研究等重要內(nèi)容。檢測體系開發(fā)完成后，需依據(jù) ICH 及藥典要求開展分析方法驗證評估，確保體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度、專屬性及耐用性均滿足法規(guī)要求。

釀酒酵母宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測免疫策略HCP抗體能識別工藝中存在的HCP，避免有占優(yōu)勢的抗體聚集，尤其關(guān)注潛在的高風險性HCP的識別能力。

為更優(yōu)管控工藝、保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，各國監(jiān)管機構(gòu)均要求提供所用宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。通常需開展覆蓋率分析的場景主要有以下四類：①臨床II期后，若仍使用商品化試劑盒，需評估其抗體覆蓋率是否能持續(xù)滿足質(zhì)量監(jiān)控需求；②臨床III期及后續(xù)階段，若產(chǎn)品研究者開發(fā)了平臺化或工藝專屬型HCP監(jiān)測方法，此類試劑盒使用前需評估其覆蓋率水平與商業(yè)化試劑盒覆蓋率水平的差異；③申報階段若未提交覆蓋率數(shù)據(jù)，監(jiān)管機構(gòu)可能向企業(yè)提出補充提交的要求；④產(chǎn)品上市后，若發(fā)生生產(chǎn)場地變更、工藝變更、HCP分析方法變更等情況，研究者需評估變更前后抗體覆蓋率水平的差異，以及該差異對藥品質(zhì)量與安全性的影響。

LC-MS/MS 作為成熟穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，依托超高分辨率與準確度，在生物分析領域中占據(jù)關(guān)鍵地位。該技術(shù)不僅可對低含量宿主細胞殘留蛋白（HCP）開展定性檢測，還能通過構(gòu)建專屬蛋白質(zhì)譜庫準確鑒定 HCP 的具體種類，為深度解析殘留蛋白組成提供重要支撐。不過該技術(shù)應用中面臨的主要挑戰(zhàn)，是如何優(yōu)化 LC-MS 方法以契合 GMP 規(guī)范對產(chǎn)品放行檢測的嚴苛要求。在質(zhì)譜檢測環(huán)節(jié)，引入表征明確的內(nèi)標與外標蛋白，可準確分析 HCPs 的整體組成，并有效識別其中具有潛在風險的高風險蛋白。這一技術(shù)手段不僅為開發(fā)產(chǎn)品專屬 HCP ELISA 檢測方法提供有力數(shù)據(jù)支撐，還可助力工藝優(yōu)化升級，加快推進生物制品從研發(fā)到獲批上市的全流程進度。

湖州申科開發(fā)多種宿主 HCP 檢測試劑盒，提供抗體覆蓋率驗證服務。

HCP 是宿主細胞（多為哺乳動物細胞或微生物）所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)存在潛在風險，可能對藥物的安全性與有效性產(chǎn)生影響。因此，宿主細胞蛋白（HCP ）殘留量成為生物藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，需在藥物開發(fā)與生產(chǎn)階段，對 HCP 的存在進行嚴格監(jiān)控、管理并做好記錄。隨著生產(chǎn)流程推進，生物制品純度逐步提升，但 HCP 的總量與種類也在不斷減少，這無疑增加了 HCP 分析與監(jiān)測工作的難度。在此背景下，開發(fā)高效的 HCP 富集材料及技術(shù)便顯得尤為重要。低豐度宿主殘留蛋白富集試劑盒，專為富集生物制品（如單抗、融合蛋白等）中的 HCP 并去除高豐度蛋白而設計，其通過磁珠法構(gòu)建多樣化且復雜的親和配體庫，以實現(xiàn)對目標蛋白的高效識別與結(jié)合。該試劑盒的設計不僅覆蓋傳統(tǒng)單一蛋白，還可適配融合蛋白、單克隆抗體等多種生物樣本類型，體現(xiàn)出較強的適用性與靈活性。湖州申科 HCP檢測試劑盒校準品經(jīng)質(zhì)譜和二維電泳雙重表征，蛋白覆蓋較廣。成都生物制品宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒

基于HCP的復雜性，檢測中常遇到中間品，尤其是原液樣品無法達到稀釋線性，可能與樣品基質(zhì)的干擾有關(guān)。江蘇ELISA法宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測方法學驗證

宿主細胞蛋白殘留檢測中，抗體覆蓋率評估實驗的操作難度較高，需在實驗方法建立階段對關(guān)鍵步驟開展充分驗證，以確保實驗方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開發(fā)過程中已對關(guān)鍵步驟進行充分驗證，相關(guān)驗證結(jié)果已通過專業(yè)評審，具體驗證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開展優(yōu)化驗證，確保方法穩(wěn)健性；② 過程質(zhì)控：二維電泳存在實驗步驟繁瑣、時間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問題，因此在等電聚焦實驗環(huán)節(jié)引入熒光標記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過程；③ 方法重復性：針對 2D 分析與 LC-MS 分析開展重復性驗證，其中 2D 分析方法的重復性可達 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復性可達 90% 以上；④ 上樣量優(yōu)化：針對 2D 分析與 LC-MS 分析實施上樣量驗證，規(guī)避上樣量差異對檢測結(jié)果的影響；⑤ 假陽性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認 IMBS 實驗設定的步驟與參數(shù)是否會導致假陽性結(jié)果。

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標簽：內(nèi)毒素檢測熱原檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測宿主細胞殘留DNA檢測

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