廣東CHO宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測

法規(guī)推薦的抗體覆蓋率評估方法主要分為兩類：一類是傳統(tǒng) 2D-WB 法，另一類是基于抗體親和的免疫捕獲類方法。傳統(tǒng) 2D-WB 法存在諸多不足，如需對蛋白進(jìn)行變性處理、樣品需前處理（會破壞蛋白天然表位）、轉(zhuǎn)膜效率較低、易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)等，因此難以準(zhǔn)確反映真實(shí)的覆蓋率水平。湖州申科自主研發(fā)了免疫磁珠捕獲分離技術(shù)（immunomagnetic beads separation，IMBS），該技術(shù)借助免疫磁珠的半液態(tài)特性，能在懸浮狀態(tài)下與 HCP 樣本充分混勻并結(jié)合；整個(gè)過程中蛋白無需變性，且結(jié)合方式與 ELISA 檢測條件相近，從而可獲得更貼近真實(shí)情況的覆蓋率結(jié)果。

LC-MS/MS 作為成熟穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，依托超高分辨率與準(zhǔn)確度，在生物分析領(lǐng)域中占據(jù)關(guān)鍵地位。該技術(shù)不僅可對低含量宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）開展定性檢測，還能通過構(gòu)建專屬蛋白質(zhì)譜庫準(zhǔn)確鑒定 HCP 的具體種類，為深度解析殘留蛋白組成提供重要支撐。不過該技術(shù)應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)，是如何優(yōu)化 LC-MS 方法以契合 GMP 規(guī)范對產(chǎn)品放行檢測的嚴(yán)苛要求。在質(zhì)譜檢測環(huán)節(jié)，引入表征明確的內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)蛋白，可準(zhǔn)確分析 HCPs 的整體組成，并有效識別其中具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的高風(fēng)險(xiǎn)蛋白。這一技術(shù)手段不僅為開發(fā)產(chǎn)品專屬 HCP ELISA 檢測方法提供有力數(shù)據(jù)支撐，還可助力工藝優(yōu)化升級，加快推進(jìn)生物制品從研發(fā)到獲批上市的全流程進(jìn)度。

昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（IC-BEVS）是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，以桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞為宿主實(shí)現(xiàn)外源蛋白的生產(chǎn)。該系統(tǒng)具備便于規(guī)模化生產(chǎn)、培養(yǎng)成本低、生物安全性高等優(yōu)勢，近年已逐步應(yīng)用于重組蛋白、rAAV 載體、亞單位疫苗（如病毒樣顆粒（VLP）疫苗）等產(chǎn)品的生產(chǎn)，在生物制品重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。Sf9 細(xì)胞系源自草地夜蛾細(xì)胞系（Spodoptera frugiperda cell line，簡稱 Sf），是當(dāng)前較為常用的昆蟲細(xì)胞系之一。SHENTEK^® Sf9 HCP 殘留蛋白檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），可對采用 Sf9 細(xì)胞系生產(chǎn)的生物制品中宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留進(jìn)行定量檢測。該試劑盒的抗體覆蓋率分別為 70.4%-96.0%（采用 IMBS-2D 法）和 91.2%（采用 IMBS-MS 法，Unique Peptide ≥2）。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，例如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，在生產(chǎn)工藝中會因細(xì)胞分泌、死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程里，有三大因素主要影響 HCP 的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在 HCP 數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會表達(dá)，部分基因的表達(dá)具有時(shí)間和條件特異性；像大腸桿菌約含 4300 個(gè)基因，不同工藝產(chǎn)物會經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，這增加了 HCP 的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究顯示，大腸桿菌表達(dá)的蛋白間存在數(shù)量差異，這種差異可能是對環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但 85-90% 具有潛在免疫原性的 HCP 在不同發(fā)酵過程中均會出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，還有融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性的影響：純化過程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量殘留 HCP 留在產(chǎn)品中，這些殘留 HCP 可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同被純化。

為何定制化試劑盒會成為宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測的優(yōu)先選擇？關(guān)鍵原因與檢測準(zhǔn)確性、藥物安全性緊密關(guān)聯(lián)。HCP ELISA 檢測屬于多分析物檢測技術(shù)，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，高度依賴校準(zhǔn)品品質(zhì)、抗體質(zhì)量及檢測方法的構(gòu)建。定制化 HCP ELISA 檢測試劑盒的主要優(yōu)勢，在于其依托更具代表性的 HCP 抗原對動物進(jìn)行免疫，由此制備的 HCP 抗體針對性更突出。這類針對性抗體可大幅降低 HCP 漏檢風(fēng)險(xiǎn)，特別是針對生產(chǎn)工藝中特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCP 因子，能呈現(xiàn)更優(yōu)的檢出成效，為藥物的安全性、有效性及質(zhì)量可控性提供堅(jiān)實(shí)保障。

美國藥典 <1132> 與歐洲藥典 < 2.6.34 > 建議，對即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)（臨床 III 期及后續(xù)階段）或生產(chǎn)工藝已穩(wěn)定的生物制品，采用定制化 ELISA 試劑盒開展宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測，背后原因主要包括四點(diǎn)：①確保檢測方法能充分覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)生的 HCPs，防止漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②為更準(zhǔn)確的免疫原性與安全性評估提供支持；③提供真實(shí)的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測性數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制對方法一致性的要求。此外，研究人員對當(dāng)前市場常見的 HCP ELISA 商業(yè)化試劑盒進(jìn)行測試，并將其與 HCP ELISA 定制化試劑盒對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同商業(yè)化試劑盒檢測同一樣品的數(shù)值差異明顯，且準(zhǔn)確性均低于定制化試劑盒 —— 這一結(jié)果表明，定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制的實(shí)際需求。