北京熱原檢測法規(guī)要求

湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT 法，貨號 1502100）包含完整的檢測體系，組分按功能可分為細(xì)胞培養(yǎng)類、ELISA 檢測類與輔助類，且儲(chǔ)存條件明確。細(xì)胞培養(yǎng)類組分包括：2-8℃儲(chǔ)存的培養(yǎng)液（25mL×2 瓶）、96 孔細(xì)胞孵育板，-18℃儲(chǔ)存的培養(yǎng)液添加劑（1.5mL×1 管）、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，以及需液氮保存的 MAT 細(xì)胞（2 支），確保細(xì)胞活性與穩(wěn)定性。ELISA 檢測類組分涵蓋：2-8℃儲(chǔ)存的生物素偶聯(lián)抗 IL-6 抗體（200×，60μL）、鏈霉親和素 HRP 復(fù)合物（100×，140μL）、TMB 顯色液（12mL）、終止液（6mL），以及抗 IL-6 預(yù)包被酶標(biāo)板（8 孔 ×12 條），無需額外制備抗體，即開即用。輔助類組分包括細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（8mL×1 管）、稀釋液（25mL）、濃縮緩沖液（10×，25mL×2 瓶）與封板膜，滿足從樣品稀釋到檢測終止的全流程需求。各組分儲(chǔ)存條件嚴(yán)格區(qū)分，避免因儲(chǔ)存不當(dāng)導(dǎo)致性能下降，保障檢測結(jié)果可靠。

革蘭氏陽性菌注射劑產(chǎn)品只依賴內(nèi)毒素檢測存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對此，風(fēng)險(xiǎn)評估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開展家兔法與內(nèi)毒素檢測的一致性實(shí)驗(yàn)，對比兩種方法的檢測結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測，其通過單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測陽性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來源；三是若無法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內(nèi)毒素檢測。尤其對于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒（MAT法）已完成 25 個(gè)品種樣品的檢測驗(yàn)證，覆蓋單抗類、疫苗類、基因工程類、血液制品類、生化藥品類與注射液，結(jié)果顯示其適配性范圍廣但需關(guān)注部分樣品的干擾。疫苗類（如麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗、人用狂犬病疫苗）、基因工程類（重組人促紅素、干擾素 α-2b）、血液制品類（人血白蛋白、凝血因子 Ⅷ）與注射液（生理鹽水、琥珀酰明膠）的加標(biāo)回收率均在 50%-200% 范圍內(nèi)，無明顯干擾，檢測結(jié)果可靠。單抗類（如貝伐珠單抗、阿達(dá)木單抗）、中藥注射液等樣品雖存在不同程度的抑制作用，需通過提高稀釋倍數(shù)（如稀釋至 MVD 上限）、超聲處理或添加中和劑消除抑制，優(yōu)化后回收率均可達(dá)標(biāo)。此外，MAT 法可有效檢測非內(nèi)毒素?zé)嵩鐚ω惙ブ閱慰棺⑸湟褐刑砑拥慕湍付嗵牵╖ymosan，200μg/mL）、脂磷壁酸（LTA，10μg/mL），回收率分別達(dá) 113%、66.8%，證明其可解決傳統(tǒng)鱟試劑漏檢非內(nèi)毒素?zé)嵩膯栴}，尤其適用于高風(fēng)險(xiǎn)生物制品的熱原防控。

在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測信號波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測 ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場成熟度高、跨平臺兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

在 MAT 熱原檢測中，單核細(xì)胞系與 PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的檢測結(jié)果穩(wěn)定性差異明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，單核細(xì)胞系的標(biāo)曲 R2 達(dá) 1.000，各濃度點(diǎn) CV 值極低（如 ST1 為 0.92%、ST2 為 1.5%），相對偏差均在 5% 以內(nèi)；而 PBMC 的標(biāo)曲 R2 為 0.997，部分濃度點(diǎn) CV 值超 20%（如 ST2 為 39.6%、ST6 為 45.5%），相對偏差高達(dá) 171.43%。這種差異源于兩者對熱原反應(yīng)的一致性—單核細(xì)胞系能穩(wěn)定釋放 IL-6，PBMC 則因供體差異導(dǎo)致 IL-6 釋放水平波動(dòng)，直接影響熱原檢測結(jié)果的重復(fù)性，單核細(xì)胞系更適配準(zhǔn)確的熱原定量需求。